تمايز مايكوباكتريوم توبركولوزيس ازمايكوباكتريوم بويس با استفاده ازآناليز شيميايي اسيدهاي مايكولي

دكترسيد اصغر هوائي- دكتر تقي ناصرپورفريور- دكتر حسن تميزيفر- دكترغلآامعلي نادري

استاديار گروه باكتري و ويروس شناسي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي - درماني استان اصفهان گروه باكتري و ويروس شناسي دانشكده پزشكي دانشگاهعلومپزشكيوخدماتبهداشتي-درمانياستانسيستانوبلوچستان استاديار گروه باكتري و ويروس شناسي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي - درماني استان اصفهان استاديار مركز تحقيقات قلب و عروق دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي - درماني استان اصفهان



عليرغم‌ اين‌ كه‌ اكثر موارد سل‌ انساني‌ توسط‌ مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌ صورت‌ مي‌گيرد، مواردي‌ از عفونتهايي‌ كه‌ توسط‌ مايكوباكتريوم‌ بويس‌ به‌ وجود مي‌آيند نيز بطور روز افزوني‌ گزارش‌ مي‌گردند(3-1). روشهاي‌ كلاسيك‌ تمايز اين‌ دو گونه‌ براساس‌ تست‌ احياء نيترات‌، فعاليت‌ پيرازين‌ آميداز، حساسيت‌ به‌ پيرازين‌ آميد، تجمع‌ نياسين‌ و رشد در محيط‌ حاوي‌ تيوفن‌ 2- كربوكسيليك‌ اسيد هيدرازيد است‌. بعضي‌ از اين‌ روشها، مشكل‌ و وقت‌گير هستند و به‌ ندرت‌ در آزمايشگاههاي‌ تشخيصي‌ بكار برده‌ مي‌شوند. با اين‌ وجود، از نقطه‌ نظر كلينيكي‌، به‌ دليل‌ مقاومت‌ M.bovis به‌ پيرازين‌ آميد و همچنين‌ اپيدميولوژيكي‌، به‌ دليل‌ نوع‌ اپيدمي‌هايي‌ كه‌ اين‌ باكتريها در آنها درگير مي‌باشند، تمايز اين‌ دو باكتري‌ از يكديگر كاملاً لازم‌ و ضروري‌ است‌(4).

روشهاي‌ گوناگون‌ ژنتيكي‌ نيز براي‌ تمايز اين‌ دو باكتري‌ استفاده‌ شده‌ است‌. بعضي‌ از اين‌ روشها در دست‌ بررسي‌ مي‌باشند (4) و بعضي‌ از روشهاي‌ ديگر با مشكلاتي‌ همراه‌ بوده‌ است‌. سالها قبل‌، ژن‌ mtp 40 كه‌ تصور مي‌شد در M.tuberculosis وجود دارد امّا در M.bovis نيست‌، شناسايي‌ و مشخص‌ گرديد (5). در ابتدا تكنيك‌ تكثير PCR اين‌ ژن‌ براي‌ تمايز مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌ از مايكوباكتريوم‌ بويس‌ بكار برده‌ شد (6). امّا با مشخص‌ شدن‌ اين‌ نكته‌ كه‌ اين‌ ژن‌ در تمام‌ سويه‌هاي‌ مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌ وجود ندارد و همچنين‌ در بعضي‌ از سويه‌هاي‌ M.bovis وجود دارد، ديگر معتبر نيست‌ (7). توالي‌ نوكلئوتيدهاي‌ ژن‌ katG مايكوباكتريوم‌ بويس‌ نيز مشابه‌ مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌ است‌ با اين‌ تفاوت‌ كه‌ در موقعيت‌ 1388 بجاي‌ بازالي‌ گوانين‌، تيمين‌ قرار دارد (8). روشهاي‌ مرسوم‌ آناليز اسيدهاي‌ مايكوليك‌ ديوارة‌ سلولي‌ مايكوباكتريومها نيز كه‌ تاكنون‌ براي‌ تمايز مايكوباكتريومها بكار برده‌ مي‌شود، نتايج‌ مشابهي‌ را در مورد اين‌ دو باكتري‌ نشان‌ مي‌دهند (10 و 9). در روشهاي‌ HPLC بكار برده‌ شده‌، نكتة‌ تشخيصي‌، اسيدهاي‌ مايكوليك‌ با تعداد كربنهايي‌ متوسط‌ و بالا مورد نظر بوده‌ است‌ (11-9) امّا گزارشهايي‌ نيز در مورد وجود تفاوتهايي‌ در اسيدهاي‌ مايكوليك‌ كوتاه‌ زنجيره‌ وجود دارد(12). در روشهاي‌ فوق‌الذكر، به‌ دليل‌ آنكه‌ توجه‌ به‌ چنين‌ اسيدهاي‌ مايكوليك‌ بلند زنجيره‌ بوده‌ است‌، پروسه‌هاي‌ آماده‌سازي‌ و آناليز نيز جهتي‌ به‌ اين‌ سو داشته‌اند. با عنايت‌ به‌ اين‌ موارد، در اين‌ بررسي‌ اقدام‌ به‌ تغيير در پارامترهاي‌ HPLC در جهت‌ شناسايي‌ اسيدها مايكوليك‌ كوتاه‌ زنجيره‌ نموده‌ و با توجه‌ به‌ تغييرات‌ صورت‌ گرفته‌، موفق‌ به‌ مشخص‌ كردن‌ تفاوتهاي‌ قابل‌ تكراري‌ در پيكهاي‌ كروماتوگرامهاي‌ سويه‌هاي‌ مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌ و بويس‌ مورد بررسي‌ در اين‌ تحقيق‌ شديم‌.

روشها

سويه‌هاي‌ بكار برده‌ شدة‌ مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌، از مركز تحقيقات‌ سل‌ و بيماريهاي‌ ريوي‌ بوده‌ و كلية‌ تستهاي‌ بيوشيميايي‌ در آن‌ مركز بر روي‌ اين‌ سويه‌ها صورت‌ گرفته‌ است‌. سويه‌هاي‌ M.bovis ، استاندارد M.bovisATCC19210 و سه‌ سويه‌ از سويه‌هاي‌ كشتارگاه‌ دام‌ بوده‌ كه‌ الگوي‌ HPLC مشابه‌ M.tuberculosis داشته‌اند (13) امّا تست‌ نياسين‌ و نيترات‌ آنها منفي‌ بوده‌، كند رشد و nonchromogen نيز بوده‌اند (تفكيك‌ M.tuberculosis ).

اسيدهاي‌ مايكوليك‌ اين‌ باكتريها پس‌ از كشت‌ اوّليه‌ بر روي‌ محيط‌ لونشتين‌- جانسون‌، صابوني‌ و استخراج‌ گرديده‌ و سپس‌ عمل‌ مشتق‌سازي‌ را به‌ اين‌ صورت‌ اصلاح‌ كرده‌ و بجاي‌ استونيتريل‌ به‌ همراه‌ پارابروموفناسيل‌ برومايد و تركيب‌ 18 Crown ، از كلروفورم‌ به‌ همراه‌ اين‌ مواد استفاده‌ نموديم‌. به‌ اين‌ ترتيب‌، چون‌ اسيدهاي‌ مايكوليك‌ بلند زنجيره‌ در كلروفورم‌ بيشتر حل‌ مي‌گردند، بنابراين‌، عمل‌ مشتق‌سازي‌ بر روي‌ اسيدهاي‌ چرب‌ با زنجيره‌هاي‌ كمتر اتم‌ كربن‌ صورت‌ مي‌گيرد (14) بقية‌ مراحل‌ انجام‌ آزمايش‌ مانند روشهاي‌ قبل‌ بوده‌ است‌ (13). به‌ همراه‌ هر نمونه‌ مقدار 5 ميكروليتر هگزان‌ كه‌ هيچ‌ گونه‌ نگهداري‌ از آن‌ توسط‌ ستون‌ صورت‌ نمي‌گيرد و كاملاً غير قطبي‌ است‌، به‌ ستون‌ تزريق‌ شد تا بتوان‌ زمانهاي‌ بازداري‌ را نسبت‌ به‌ آن‌ سنجيد.

شرايط‌ انجام‌ HPLC نيز به‌ صورت‌ ذيل‌ تغيير داده‌ شد. از گراديان‌ متانول‌ و دي‌ كلرومتان‌ به‌ اين‌ صورت‌ استفاده‌ گرديد كه‌ ابتدا غلظت‌ كلروفورم‌ 98 درصد قرار داده‌ شد، سپس‌ در مدت‌ يك‌ دقيقه‌ مقدار آن‌ به‌ 80 درصد تقليل‌ داده‌ شد و در مدت‌ 25 دقيقه‌ به‌ ميزان‌ 30 درصد رسيد و در طي‌ 2 دقيقه‌ مجدداً به‌ 98 درصد افزايش‌ يافته‌ و مدت‌ 2 دقيقه‌ در همين‌ شرايط‌ نگه‌ داشته‌ شد. سرعت‌ جريان‌ ml/min 6/0 بوده‌ و متانول‌ و دي‌ كلرومتان‌ مورد استفاده‌ از شركت‌ Merck و از درجة‌ HPLC بوده‌اند.



نتايج‌

نتايج‌ حاصل‌ از آماده‌ سازي‌ و تزريق‌ نمونه‌هاي‌ مورد بررسي‌ به‌ دستگاه‌ HPLC با شرايط‌ مذكور در بخش‌ مواد و روشها، به‌ صورت‌ كروماتوگرامهاي‌ ذيل‌ حاصل‌ شده‌اند. محور افقي‌ اين‌ كروماتوگرامها، زمان‌ بازداري‌ و محور عمودي‌ ميزان‌ جذب‌ در nm 260 را نشان‌ مي‌دهد.

كروماتوگرام‌ 1 مربوط‌ به‌ M.bovis است‌ و كروماتوگرام‌ 2 مربوط‌ به‌ M.tuberculosis . همانطور كه‌ از مقايسة‌ اين‌ كروماتوگرامها مشخص‌ مي‌شود اين‌ دو باكتري‌ در پيكهاي‌ شمارة‌ 4-1 خود با يكديگر اختلاف‌ دارند. اين‌ اختلاف‌ به‌ صورت‌ قابل‌ تكرار در تمام‌ سويه‌هاي‌ مورد بررسي‌ وجود داشته‌ و در سويه‌هاي‌ متعلق‌ به‌ يك‌ گونه‌ تشابه‌ كامل‌ در اين‌ پيكها مشاهده‌ شده‌ است‌. اختلافات‌ مربوط‌ به‌ دو گونه‌ عمدتاً به‌ اختلاف‌ در ارتفاعات‌ پيكهاي‌






كروماتوگرام‌ 2. نمونه‌ پيك‌ مربوط‌ به‌ M.tuberculosis با روش‌ اصلاح‌ شده‌ HPLC




كروماتوگرام‌ 1. نمونه‌ پيك‌ مربوط‌ به‌ M.bovis با روش‌ اصلاح‌ شده‌ HPLC

سويه‌هاي‌ M.bovis و M.tuberculosis به‌ كار رفته‌ در اين‌ تحقيق‌، اگر چه‌ الگوهاي‌ مشابه‌ و قابل‌ تكراري‌ در داخل‌ هر كدام‌ از گونه‌ها مشاهده‌ مي‌شود ولي‌ در بين‌ دو گونه‌ در كروماتوگرامهاي‌ 1 و 2 اختلاف‌ قابل‌ مشاهده‌اي‌ ملاحظه‌ مي‌گردد.

نتايج‌ حاصل‌ از اين‌ تحقيق‌ با نتايج‌ مطالعات‌ انجام‌ شدة‌ قبلي‌ Thiebert (9) و Floyd (10) كه‌ الگوهاي‌ كروماتوگرام‌ دومايكوباكتريوم‌ را مشابه‌ مي‌دانستند، اختلاف‌ دارد. علت‌ اين‌ تفاوت‌ ممكن‌ است‌ در نكات‌ ذيل‌ باشد كه‌ در مجموع‌ شرايط‌ حاضر


نظير آنها (غلظت‌ هر يك‌ از مشتقات‌) برمي‌گردد و با مقايسة‌ اين‌ ارتفاعات‌ با ارتفاع‌ پيك‌ مربوط‌ به‌ هگزان‌، مي‌توان‌ با اختلافات‌ موجود در3 فاكتور زمان‌ بازداري‌ نسبي‌، سطح‌ زير منحني‌ نسبي‌، ارتفاع‌ نسبي‌ پيكها نسبت‌ به‌ شناسايي‌ و تمايز دو مايكوباكتريوم‌ بويس‌ و توبركولوزيس‌ از يكديگر اقدام‌ كرد(جدول‌ 1).



بحث‌

بررسي‌ كروماتوگرامهاي‌ يك‌ و دو نشان‌ مي‌دهد كه‌ بين



جدول‌ 1. مشخصات‌ منحني‌هاي‌ مربوط‌ به‌ نمونه‌هاي‌ مايكوباكتريوم‌ بويس‌ و مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌ مورد آزمايش‌

شماره‌ پيك‌ 1 2 3 a 4 b 4

فاكتور

مايكوباكتريوم‌ بويس‌

زمان‌ بازداري‌نسبي‌ ( RRT ) (دقيقه‌) 01/0 ‏ 2/29:6 02/0 ‏ 8/32:9 01/0 ‏ 0/22:11 01/0 ‏ 7/36:21 -

سطح‌ زير منحني‌ نسبي‌ ( RPA ) 01/0 ‏ 23/12 01/0 ‏ 75/4 01/0 ‏ 30/24 01/0 ‏ 38/10

ارتفاع‌ نسبي‌ ( RPH ) 01/0 ‏ 17/9 01/0 ‏ 16/2 01/0 ‏ 27/14 01/0 ‏ 51/4

مايكوباكتريوم‌ توبركولوزيس‌

زمان‌ بازداري‌ نسبي‌ ( RRT ) 01/0 ‏ 9/55:5 01/0 ‏ 6/53:7 01/0 ‏ 0/45:9 01/0 ‏ 8/15:16 01/0 ‏ 7/18:16

سطح‌ زير منحني‌ نسبي‌ ( RPA ) 01/0 ‏ 34/52 01/0 ‏ 57/6 01/0 ‏ 21/35 01/0 ‏ 7/18:16 01/0 ‏ 43/26

ارتفاع‌ نسبي‌ ( RPH ) 01/0 ‏ 30/22 01/0 ‏ 23/2 01/0 ‏ 32/12 01/0 ‏ 07/8 01/0 ‏ 80/7






را براي‌ جداسازي‌ و تمايز اين‌ دو باكتري‌ مناسبتر مي‌سازد: نحوة‌ مشتق‌سازي‌ در استفاده‌ از كلروفورم‌ بجاي‌ استونيتريل‌ (13)؛ هدف‌ مشتق‌سازي‌ (مشتق‌سازي‌ اسيدهاي‌ مايكوليك‌ كوتاه‌ زنجيره‌) (13)؛ استفاده‌ از گراديان‌ متانول‌ - دي‌ كلرومتان‌ (دي‌ كلرومتان‌ انديس‌ قطبيت‌ كمتري‌ نسبت‌ به‌ كلروفورم‌ دارد) (14)؛ تفاوت‌ در زمانها و غلظتهاي‌ شستشو.

مطالعات‌ انجام‌ شده‌ توسط‌ Thiebert (9) نيز به‌ دليل‌ استفاده‌ از همان‌ روشهاي‌ قبلي‌ (13-10)، محقق‌ موفق‌ به‌ يافتن‌ مقالات‌ بيشتري‌ كه‌ مرتبط‌ باموضوع‌ اين‌ تحقيق‌ باشد، نشده‌است‌)، قادر به‌ تمايز مايكوباكتريومهاي‌ توبركولوزيس‌ و بويس‌ نبوده‌ است‌.

در استفاده‌ از GLC براي‌ شناسايي‌ مايكوباكتريومها نيز تغيير در هدف‌ جداسازي‌ (تغيير در اسيدهاي‌ مايكوليك‌ با تعداد خاصي‌ از اتمهاي‌ كربن‌ در اين‌ اسيدها) كمك‌ به‌ تمايز و جداسازي‌ مايكوباكتريومهايي‌ كرده‌اند كه‌ با روش‌ معمولي‌ GLC كه‌ به‌ صورت‌ ميكروسافتهاي‌ تجارتي‌ ارائه‌ شده‌اند و آزمايشگاهها از اين‌ ميكروسافتهاي‌ تجارتي‌ استفاده‌ مي‌كنند، قابل‌ جداسازي‌ نبوده‌اند.

Bottger (15) كه‌ M.genavense در روش‌ GLC با M.fortuitum را به‌ علت‌ اشتباه‌ در محدوديتهاي‌ ميكروسافتهاي‌ تجاري‌ ارائه‌ شده‌ توسط‌ ( MIS ) Microbiol Identification System عنوان‌ مي‌كند و معتقد است‌ با توجه‌ به‌ ساير فاكتورهايي‌ كه‌ مورد توجه‌ اين‌ سيستم‌ در شناسايي‌ نيست‌، مي‌توان‌ به‌ سهولت‌ اين‌ دو باكتري‌ را از هم‌ تفكيك‌ نمود. شايد در مورد استفاده‌ از HPLC و عدم‌ توانايي‌ شناسايي‌ دو مايكوباكتريوم‌ بويس‌ و توبركولوزيس‌ نيز استفاده‌ از ميكروسافتهايي‌ باشد كه‌ تكيه‌ بر اسيدهاي‌ مايكوليك‌ با وزن‌ ملكولي‌ بالا (و نه‌ استفاده‌ از اسيدهاي‌ مايكوليك‌ كوتاه‌ زنجيره‌) دارند.

قدرداني‌: از معاونت‌ پژوهشي‌ دانشگاه‌ علوم‌ پزشكي‌ اصفهان‌ كه‌ بودجه‌ اين‌ تحقيق‌ را در اختيار پژوهشگران‌ قرار دادند تشكر و قدرداني‌ مي‌گردد