جمع آوری و انباشتن

مقدمه :

فقط تعداد کمی از حشرات سپردار نرم تن بوسیله خصوصیات ظاهری و گیاهان میزبان و محل آلودگی مورد مطالعه قرار می گیرند. در حالی که تعداد زیادی از آنها حتی در این رده قرار نمی گیرند. بنابراین اکثر زیادی از گونه ها باید وسیله مطا لعات میکروسکوپی به طور دقیق شناسایی شوند که در این روش نمونه های مجتمع روی اسلاید قرار می گیرند.این اسلاید ها به منظور فراهم کردن نمونه ها و مطا لعه آنها در اواسط قرن گذشته نیز مورد استفاده قرار می گرفتند. متخصصینی مثل آقای گریل در سال 1896 نیوزتید در سال 1903 و استین وی دن در سال 1929 روشهای مخصوصی را برای تهیه و انباشته کردن حشرات سپردار جهت مطا لعات میکروسکوپی ارائه دادند و این روشها اخیرا موردبازنگری و اصلاح قرار گرفته اند.آقایان سیلیر 1967 ،کوزارزیواسکی 1968 ، ویلیام وکستاراب 1972 و ویلی 1990 از کسانی بودند که این اصلاحات را انجام دادند . در این درس جمع آوری و روش نگهداری حشرات سپردار( coccidae) و روشهای نوین که باعث تهیه اسلاید های با کیفیت جهت مطالعات میکروسکوپی می شوند بررسی و مورد بحث قرار گرفته که این اسلاید ها هم از مواد تازه و هم از موادی که مدتها در انبار نگهداری شده اند به صورت خشک و مرطوب تهیه می شوند.در اینجا بیشترین تمرکز بر روی مراحلی مانند مرحله پوره و مرحله کامل حشره ماده بوده اما کمی هم در خصوص حشرات نر نیز مطالعه صورت گرفته است. این درس همچنین خصوصیات مورفولوژیکی حشرات سپردار را جهت بازیافت و فعال کردن مواد نگهدارنده برای مطالعات بیشتر مورد بحث قرار می دهد.



جمع آوری:

حشرات سپردار نرم تن ممکن است در هر قسمتی از گیاه میزبان ظاهر گردند یعنی از ریشه گرفته تا میوه . بعضی از گونه های سپردار به علت داشتن تخمدان های سفید و ضخیم کاملا قابل مشاهده می باشند که گاهی نیز رنگارنگ بوده و بوسیله مواد واکسی پوشیده شده اند. اما دیگر ارقام به سادگی قابل شناسایی نمی باشند .زیرا با تغییر وضعیت آب وهوایی خودشان را تغییر می دهند و یا کاملا پوشیده می باشند. عواملی که باعث شناسایی این حشرات توسط شخص جمع آوری کننده می شود عبارتند از:

مشاهده شدید فعالیت مورچه ها ،وجود شیره های چسبنده و بالاخره حضور آلودگی قارچ های سیاه رنگ .سپرداران نرم تن معمولا بر روی شاخه های درختان مخصوصا جاهایی که سایه بیشتری وجود دارد بر روی حفره های موجود بر تنه درختان و در بین جوانه ها و دیگر جاهای گیاه حضور دارند. در تمام گیاهان توجه به نقاطی مثل ریشه ها ، طوقه ،برگها،میوه ها و زیر پوسته تنه اهمیت بسیاری دارد. علاوه بر این می توان سپرداران نرم تن را در بقایای گیاهی نیز مشاهده و جمع آوری نمود.در حالی که بعضی از حشرات خانواده coccoide را می توان در بقایای گیاهی و برگهای مرده پیدا کرد. اما سپرداران نرم تن هیچگاه جدا از میزبان گیاهی نمی باشند. حشره نر سپردار نرم تن اغلب در کنار حشره ماده بر روی گیاه میزبان می باشد. اما حشرات دیگر این خانواده که به صورت خزیده حرکت می کنند. خصوصا نوع نر آنها به طور پراکنده در قسمتهای مختلف گیاه میزبان و یا دیگر گیاهان به طورجداگانه دور از نوع ماده مشاهده می شوند. حشرات نر را می توان بوسیله تله های مکنده، تله های رنگی، تله های چسبنده و تله های نوری جمع آوری نمود. وجود این نوع حشرات نر در کنار ماده هایشان تقریبا غیرممکن می باشد. اما وقتی که از تله های جنسی استفاده می شود می توان آنها را به راحتی جمع آوری نمود. به منظور تهیه و جمع آوری نمونه های عالی لازم است تا حشره ماده در مدت کوتاهی جمع آوری گردد. همچنین حشره در مرحله آخر پوست اندازی و دگردیسی باشد. زیرا در بسیاری از گونه ها ،بدن حشره به سرعت بزرگ و متورم شده و سپس سخت می گردد. جمع آوری نمونه های جوان راحتر می باشد. زیرا جمعیت جمع آوری شده شامل حشره ماده بالغ ،لارو و سنین مختلف حشره می باشد.

اما گونه های جمع آوری شده مخصوصا از مناطق معتدل و سرد احتیاج به مراقبت ویژه داشته زیرا این نمونه ها معمولا در یک مدت زمان بسیار کوتاه در سال قابل دسترسی می باشند.



حفظ و نگهداری:

باید حشرات جمع آوری شده را فورا بر روی اسلاید منتقل نمود. اما لازم است که به دقت آنها برای مطالعات آینده نگهداری شوند. به هر حال نگهداری مواد زائد برای آزمایش های بعدی نیز مناسب می باشد.



نگهداری به روش مرطوب:

هر چند نمونه های نگهداری شده در مایعات مختلف معمولا اسلاید های خوبی را نسبت به نمونه های خشک به وجود نمی آورند، اما تهیه مناسب آنها می تواندبا دقت و حوصله همراه باشد تا بتوان آنها را سال ها نگهداری کرد.بهترین ماده نگهداری کننده محلول اسید الکل و یا اسید لاکتیک و الکل می باشد. مشکل این مواد این است که الکل می تواند به سرعت تبخیر گردد و نمونه زرد و خشک شود. به این دلیل باید بعد از مدتی آن را به مایع اضافه کرد. بهترین ظروف نگهداری بطریهای شیشه ای با درب پیچی واشردار می باشد.حتی می توان بطری های کوچک را درون بطری های بزرگ حاوی الکل که درب آنها به راحتی بسته می شود نگهداری نمود. در حالی که مواد نگهداری شده در محلول را می توان بسیار بهتر از نمونه های خشک جابجا و انتقال داد.اما باید تمام حباب های هوا را در بطری ها که می تواند باعث از بین رفتن و خراب شدن مواد گردد،خارج کرد. بطری ها باید هر کدام جداگانه برچسب خورده و نکات لازم مثل تاریخ جمع آوری و دیگر اطلاعات بر روی آن نوشته شود.



نگهداری روش خشک :

نمونه هایی که حتی یکصد سال قبل جمع آوری شده اند وبه صورت خشک نگهداری می شوند، می توانند به صورت بهترین نمونه اسلایدی درآیند. نگهداری مواد به صورت خشک احتیاج به دقت زیادی دارد. زیرا بسیاری از گونه های خانواده coccidae دارای آب بسیار بوده که باید قبل از نگهداری به دقت خشک شده و آب خود را از دست بدهند.

از دست دادن آب باید یا بوسیله حرارت دادن ملایم و یا نگهداری در محل های خشک صورت گیرد. البته مشکلات زیادی نیز در این خصوص وجود دارد.اولین مشکل این است که ممکن است نمونه های خشک توسط سوسک های موزه ای و دیگر آفات انباری آسیب بینند.

بنابراین سپرداران باید اولا در ظروف بدون هوا و در خلاء همراه با نفتالین نگهداری گردند. دوم اینکه حشرات خشک شده بسیار شکننده بوده و ممکن است به راحتی شاخک ،پاها و دیگر قسمتهای بدن را از دست بدهند.مخصوصا اگر مواد مرتبا جابجا و دست به دست گردند .بنابراین نباید به آنها دست زد و یا مرتبا چک کرد. البته اگر آنها در ظروف با کیفیت عالی و مطمئن و در کمد نگهداری شوند، سالم خواهند ماند. نمونه های خشک را می توان در کمد های کوچک، ظروف شیشه ای و یا پلاستیکی که در دستمال کاغذی پیچیده شده باشند و داخل آنها حاوی پنبه یا پشم شیشه باشد نگهداری نمود تا نمونه ها جابجا نگردد.سپس این ظروف را می توان در کمد های بزرگ ضد حشره نگهداری کرد. فرستادن و انتقال نمونه از طریق پست اصلا جایز نمی باشد. زیرا باعث خراب شدن آنها می شود. تمام نمونه ها باید به طور کامل برچسب داشته باشند.



تهیه اسلاید:

روش های گوناگونی در خصوص نگهداری و اسلاید کردن حشرات سپردار بوسیله شرکت های مختلف ارائه شده است.همچنین روش هایی بوسیله ی آقایان سیلیرز(1967)،ویلیامز و کستاراب(1972) برای خانواده شبهه سپرداران و آقای ویلکی (1990) برای شته ها ارائه شده است. هر چند این روش ها برای سپرداران نرم تن مناسب می باشند، اما ما فکر می کنیم که این روش ها به علت بزرگ بودن اندازه حشره ماده سپردار نرم تن همیشه رضایت بخش نمی باشند.

همچنین باید در نظر گرفته شود که برای تمام مراحل زندگی مثل مرحله لارو و مرحله بلوغ حشره نر باید کانادابلاسم دائمی که جهت مطالعات طبقه بندی و کلیدی ارزشمند و مناسب می باشد، استفاده نمود.



مراحل تهیه اسلاید های میکروسکوپی دائم:

اولا بهترین اسلاید ها همیشه از مواد تازه جمع آوری شده تهیه می شوند. گذشته از سن مواد،روش های تهیه اسلاید معمولا شامل پنج و یاشش مرحله می باشد. این مراحل عبارتند از مرحله ی تثبیت،ساخت،از دست دادن آب،رنگ آمیزی،واضح کردن،آب گرفتن نهایی و اسلاید کردن.

روند دقیق قابل استفاده توسط افراد کاملا متفاوت است وهر کسی روش و روند خود را ترجیح می دهد. اما روش های زیر باید در خصوص تمام مراحل چرخه زندگی سپردار نرم تن در تهیه اسلاید از آنها و بالا بردن کیفیت اسلاید ها مورد استفاده قرار گیرند تا بتوان آنها را به طور دائم نگهداری کرد. روش تهیه مواد شیمیایی مختلف که در تهیه اسلاید مورد استفاده قرار می گیرند نیز در جدول 1 نشان داده شده است .نقطه نظرات و روش های جایگزین نیز بعد از این روش مورد مطالعه قرار گرفته اند.

1.تثبیت ا ولیه : نمونه های زنده باید در محلول اسیداستیک و الکل به مدت یک تا دو دقیقه تثبیت گردند. تمام نمونه ها، حتی اگر بخواهیم آنها را فورا اسلاید کنیم، باید تثبیت گردند. در صورت لازم می توان مواد را برای مدت زیادی در محلول اسید-الکل نگهداری کرد.

2.مرحله ساخت: بوسیله یک شکاف کوچک در محل شکم مقداری ماده هیدرواکسید پتاسیم 10 % KOH را به درون آن انتقال می دهیم و آن را به مدت 12 الی 24 ساعت در حرارت معمولی اتاق نگهداری می کنیم. عمل واضح کردن نمونه ها با KOH ممکن است بوسیله کمی حرارت سرعت یابد. اما نباید حرارت فراتر از 40 درجه سانتیگراد برود. زیرا در غیر این صورت نمونه ها رنگ آمیزی نخواهند شد. نمونه هایی که به شدت سخت و سفت شده اند را می توان به مدت حداقل یک هفته در KOH سرد نگهداری کرد تا نرم شوند.

3. مرحله آبگیری: آبهای موجود در بدن حشره را می توان بوسیله یک لوله بسیار کوچک به آرامی به خارج از بدن پمپ و انتقال داد. بیرون آوردن مواد داخل بدن حشره و عمل آبگیری باید به آرامی و به دقت انجام گیرد تا قسمتهای مختلف بدن و محل بند ها شکسته و آسیب نبینند.زیرا این قسمتها برای شناسایی لازم می باشند. بیرون آوردن مواد داخل بدن حشره به طور کامل بسیار حیاتی بوده و مراحل رنگ آمیزی نباید تا وقتی که همه مواد خارج نگردیده اند انجام گیرد. بعد از مرحله آبگیری،نمونه ها داخل آب تمیز قرار گرفته و سپس بتدریج به آنها اسید استیک اضافه می گردد تا اسید جایگزین آب شده و غلظت آن رفته رفته به 70 % رسیده و نهایتا نمونه ها به محلول 100 % اسید انتقال یابند.

4.مرحله رنگ آمیزی: در این مرحله به نمونه هایی که در محلول 100 % اسید استیک انتقال یافته اند به میزان یک قطره فاکسین اسید جهت هر یک الی دو سی سی اسید استیک اضافه می گردد.نمونه ها به مدت 1 الی 24 ساعت در این محلول نگهداری می شوند.( به هر 1 الی 2 سی سی اسید استیک یک قطره اسید فاکسین اضافه شده و نمونه ها به مدت 1الی 24 ساعت در این محلول نگهداری می شوند تا کم کم رنگ آمیزی شوند).

5.مرحله شستشو: نمونه ها به محلول اسید استیک برا ی شستشو و خارج کردن رنگ های اضافی انتقال می یابند.

6. مرحله واضح کردن: اگر مواد زائدی مثل واکس و یا مود چرب هنوز بر روی نمونه ها یافت شوند، می توان با اضافه کردن یک قطره زایلین به محلول اسید به مدت 15 الی 30 دقیقه آنها را حل و برطرف نمود.

7.تثبیت نهایی : در این مرحله نمونه ها را به داخل روغن شبدر انتقال داده و به مدت 24 ساعت نگهداری می کنیم . هر چند 24 ساعت لازم نمی باشد، اما این مدت باعث جایگزینی کامل روغن بجای آب از دست رفته از بدن حشره شده که در غیر اینصورت ممکن است باعث متورم شدن کانادابلاسما گردد.

8. مرحله اسلاید کردن: ابتدا یک قطره کوچک کانادابلاسما را روی اسلاید می ریزیم و سپس نمونه را به آن منتقل می کنیم .بعد به آرامی نمونه را فشار داده تا به ته قطره برسد. سپس نمونه را بوسیله لامل (پوشش شیشه ای) بدقت می پوشانیم . فقط در خصوص نمونه های محدب شکل و برآمده نباید به لامل فشار داد.استفاده از لامل های سفت و یا نازکتر باعث بزرگنمایی بهتر و استفاده دقیق تر از اسلاید ها می گردد.

قرار دادن لامل بر روی نمونه های تازه تهیه شده ممکن است باعث سر خوردن و خراب شدن نمونه در زیر لامل گردد. بنابراین باید اول نمونه های تازه را در یک قطره، کانادابلاسما قرار داد و سپس آنها را روی اسلاید گذاشته و بعد اسلاید را در داخل یک پتری دیش گذاشت و درب آن را بست تا هم کثیف نگردد و هم سطح قطره کانادابلاسما در بین 15 دقیقه الی 24 ساعت خشک گردد. در آخر با گذاشتن یک قطره کانادابلاسما بر روی لامل می توان اسلاید را پوشانید.

9. مرحله برچسب زدن اسلاید ها: ازش علمی هر نمونه بستگی به اطلاعات و آمار موجود بر روی اسلاید خواهد داشت. اسلاید های که فاقد اطلاعات آماری هستند تقریبا بیهوده و بلا استفاده می باشند. بنابراین کلیه اساید ها را باید بر چسب زد و اطلا عات لازم را بر روی آنها نوشت و اطلاعات کلی رادر کتاب راهنما نیز ثبت نمود.