آموزش کالیبراسیون الایزا

یکی از مقوله های مهم در دنیای مهم کالیبراسیون می باشد. توجه به کالیبراسیون در تجهیزات آزمایشگاهی از اهمیت بیشتری برخوردار است چرا که تجهیزات آزمایشگاهی باید همواره از دقت بالایی برخوردار باشند. الایزا یکی از تجهیزات آزمایشگاهی می باشد که در زیر با آن آشنا می شوید و سپس در مورد کالیبراسیون الایزا می خوانید.



روش های سنجش ایمنی (Immunoassay) کاربرد وسیعی در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی دارند و از میان این روش ها، الایزا به دلیل ویژگی های خاص خود از جایگاه بالایی برخوردار است که به صورت روز افزون نیز بر گوناگونی و تنوع آن افزوده می شود.
به طور کلی ایمونواسی یا سنجش ایمنی عبارت است از: اندازه گیری یا شناسایی مواد خاص (تحت نام کلی آنتی ژن) با استفاده از آنتی بادی اختصاصی ضد آن ها و شامل تکنیک هایی است که در آن ها از آنتی‌ژن ها و آنتی بادی ها به عنوان ابزار ردیابی و سنجش استفاده می شود.

واکـنــش هــای سنجـش ایمنـی را بـه طـور کلـی مـی‌تـوان به دو گروه واکنش های سنجش ایمنی نــشــــان دار و غــیــــرنــشــــان دار تــقــســیــــم کـــرد، در سنجش‌های ایمنی نشاندار به کمک برخی مواد مـاننـد رادیـواکتیـو، فلئـورسنس یا آنزیم ، می‌توان آنـتــی ژن یــا آنـتــی بــادی هــا را نـشــانــدار کـرد. در روش‌های الایزا که موضوع بحث این مقاله است عمدتا از آنزیم ها جهت نشان دار کردن استفاده می‌شود.
جدا از جزئیات این روش و عوامل تأثیر گذار که بحث درباره آن ها طولانی خواهد بود، در اینجا به طـور گذرا به بررسی های لازم از بابت عملکرد صحیح اجزای این آزمایش که می بایست در یک فـاصـلـه زمـانـی مـشـخـص بـه صورت مرتب یا در فواصل تعمیر و نگهداری تجهیزات انجام پذیرد، خواهیم پرداخت.

اجزای اصلی یک آزمایش الایزا
در آزمایشگاه های تشخیص طبی، جهت انجام آزمــایـشــات سـنـجــش ایـمـنــی بــه روش الایــزا بــه امکانات زیر نیاز است:
۱- میکروپلیت ریدر
۲- میکروپلیت واشر
۳- سمپلر و عوامل پیپت کردن
۴- کیت الایزا و روش
کـیـت های الایزا، معمولا در دو مرحله مورد ارزیـابی قرار می گیرند، مرحله اول توسط تولید کننده صورت می گیرد و شامل بررسی هایی است که در مراحل ساخته شدن یک کیت انجام می گیرد و مـستقیما در ارتباط با ارزیابی تکنیکی عملکرد کیت یا شاخص های اجرایی آن است.
‌دومین بخش از ارزیابی هم توسط تولید کننده و هـم آزمـایـشـگـاه هـای تـشـخیص طبی می بایست انجام گیرد و شامل مراحل تضمین کیفیت و کنترل کیفی کیت های الایزا است.
مرحله اول ارزیابی توسط تولید کننده در مورد کیت های با روش کمی و کیفی متفاوت است . به طور مثال در مورد کیت های کمی معیارهای مهمی از جـــمـــلـــــــه دقـــــــت (Precision)، حـــســــــاســـیــــــت (Sensitivity)، صـــحــــــت (Accuracy)و ویــــــژگـــــی (Specificity)مطرح هستند.
در ایــنــجـــا نـقــش مـصــرف کـنـنــده در ارزیــابــی معیارهای مربوطه کم رنگ بوده و بیشتر در ارتباط بـا کـنـتـرل کـیفی وظایف مصرف کننده نقش پیدا می‌کند.
در مــورد تـجـهـیــزات بــه کـار رفـتـه آزمـایـشـات سنجش ایمنی با روش الایزا، باید یادآور شد که این تجهیـزات از پیچیـدگـی بـالایـی برخوردار نیستند ولی عملکرد هر کدام از آن ها به تنهایی می توانند در دریافت نتایج دقیق و صحیح نقش به سزایی داشته باشند.
بـه طـور کلـی آزمـایشگاه ها می بایست بر پایه عملکرد و توانایی تجهیزات خود، نتایج آزمایشات را به صورت روزمره صادر کنند.
به منظور اطمینان از عملکرد دقیق و تجدید پذیر مــی بــایـســت دسـتـگــاه هــا در یــک فـاصلـه زمـانـی مشخص که خاص آن دستگاه بوده و توسط مراجع ذی صـلاح مـعـرفـی مـی شـود تـوسـط پارامترهای شخصی بررسی شوند.
از سوی دیگر ارزیابی های کیفی در ارتباط با چـگـونـگـی عملکرد مجزا است حتما در فواصل مـربـوط بـه تـعـمـیـر و نـگـهداری توسط کاربران یا آزمــایـشـگـاه هـای شـرکـت هـای خـدمـات دهـنـده صورت پذیرد.



الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا
دستگاه های الایزا ریدر از هر نوعی که باشند ، تا حدودی ساختار مشابهی دارند. در بسیاری از این خوانشگرها سیستم نوری از نوع تک موج یا دو مــوج بـوده و تـا حـدودی مشـابـه سـایـر تجهیـزات فوتومتری از فیلترهای خاصی جهت ایجاد طول موج موردنظر بهره می گیرند.
در هـنـگـام اسـتـفـاده از دسـتـگـاه هـای الایزا ریدر مشکلاتی می‌تواند در آزمایشگاه مشاهده شود که این مشکلات می تواند با ساختار اپتیکی مثل کثیف بودن لنزها یا لامپ بوده یا بخش موتوری دستگاه (در انـواع اتـومـاتیک) که وظیفه جابجایی پلیت‌ها را به عهده دارد باشند. در هر صورت می بایست مطابق یـک دوره زمـانـی مـشـخـص عملکرد دستگاه مورد بررسی قرار گیرد.
در بحث نگهداری ، معمولا شرکت های سازنده و خدمات دهنده این گونه دستگاه ها پروتکل هایی بدین منظور طراحی و تنظیم کرده‌اند که در اختیار آزمایشگاه ها قرار می گیرد و کاربران مطابق با برنامه ارائه شده موظف به بازبینی بخش های در دسترس مثل حسگرها و منبع نوری هر کانال هستند . از سوی دیگر می توان کالیبره بودن دستگاه را با استفاده از فیلترهای مخصوص به نام )Grey filters( در هر یک از طـول مـوج هـای دسـتگاه سنجید در صورت عدم دسترسی به فیلترهای مذکور می توان از یک محلول رنـگی که به مقدار یکسان درون چاهک ها ریخته مـی‌شـود اسـتـفـاده کـرد. در هر صورت روش های مـخـتلفی برای بررسی کالیبره بودن دستگاه وجود دارد کـه بـه صورت جداگانه و منحصراً به ارزیابی دستگاه الایزا ریدر می پردازند.

سیستم شستشو
در روش های الایزا، شستشو به دو صورت دستی و دستگاهی است. روش دستی معمولا با استفاده از میکروپیپت های (سمپلر) تک یا ۸ کاناله و همچنین برخی دیسپنسرهای دستی انجام می گیرد.
در مراکز با حجم نمونه زیاد این روش کاربرد کمتری داشته و معمولا از سیستم های شستشوی اتوماتیک استفاده می شود.
در هر دو صورت ارزیابی شستشو عملا بررسی کارایی یا راندمان (efficiency) است. در مورد روش دستی مشکلات بیشتر مربوط به عدم کالیبره بودن سمپلر یا دیسپنسر بوده و همچنین کارایی و عملکرد پرسنل نیز مطرح خواهد بود. در روش اتوماتیک با تـوجـه بـه عملکـرد دستگـاه اشکـال در سـوزن هـای توزیع وآسپیره محلول، تنظیم نبودن یا مسدود بودن آن ها، عدم تنظیم حجم و فشار مایع شستشو و برخی موارد دیگرکه می توانند در نتایج تأثیرگذار باشند.
در اینجا هم به منظور حفظ و نگهداری روزانه، پــــروتــکــــل هــــایــــی در اخــتــیــــار کــــاربـــران از ســـوی تـولیـدکنندگان قرار می گیرد که به صورت روزانه سیستم شستشو از بابت مواردی که می تواند دچار مشکل شود بررسی شوند.
در بسیـاری از منابع ارزیابی دستگاه شستشو به کالیبراسیون تعبیر شده که همانطوری که عنوان شد عـمــلا یــک نــوع کـالیبـراسیـون نیسـت بلکـه تنظیـم پارامترها جهت افزایش راندمان آن است.

سیستم توزیع Pipettes Dispensers

سـمـپـلـرها یا میکروپیپت ها در آزمایشات الایزا کـاربـرد فـراوان دارنـد بـنـابـراین عدم داشتن دقت و صحت کافی می تواند در نتایج خوانده شده تأثیر قابل توجهی داشته باشند. سمپلرها می توانند به صورت تک یا هشت کاناله به کار گرفته شوند. صرف نظر از نوع، سمپلرها می‌بایست بر طبق میزان مصرف و نوع مواد شیمیایی به کار رفته، در یک دوره زمانی ۳ تا ۱۲ مـاه یک بار مورد بازبینی کامل و کالیبراسیون قرار گیرند.
نقـایصـی کـه مربوط به سمپلرها بوده و منجر به تغییر نتایج آزمایشات الایزا می شوند، متعدد هستند، دسته ای منشأ درونی داشته و مربوط به خود ابزار است مثل عدم عملکرد صحیح پیستون یا بخش های مربوط به آن. از طرف دیگر عدم کالیبره بودن سمپلر نیز تأثیراتی در حجم تخلیه و در نهایت تغییر نتایج خواهند داشت.
برخی از نقایص منشأ بیرونی داشته مانند مناسب نبودن نوک سمپلر و عدم تناسب آن ها که منجر به کاهش حجم مکش یا تخلیه می شود.
عــــدم وجـــود صـحـــت )accuracy( قـــابـــل قـبـــول مـی‌تـواند منجر به دریافت نتایج غیرقابل انتظار در برخی چاهک ها شده بنابراین عملکرد صحیح آن‌ها در نتایج کلی سنجش ایمنی از اهمیت فوق‌العاده ای برخوردار است.
بنا بر دستور کار ارائه شده توسط استاندارد ۸۶۵۵ ISO بـه عنوان یکی از زیر مجموعه های استاندارد ۱۷۰۲۵ ISO، می توان سمپلرها را به دو روش وزنی و رنگ سنجی کالیبره کرد.
در روش وزنـی کـه به روش های گراوی‌متری )Gravimetric Method( هم معروف است می بایست با استفاده از یک ترازوی آنالیتیکال وزن مایع توزیع شـده از سـمـپـلـر را انـدازه گـیری کرده با استفاده از دانسیته مایع، حجم دقیق و نهایتا پارامترهایی مانند مـیـانـگـیـن، انـحـراف مـعیار، ضریب تغییرات )cv( و صحت وسیله ) accuracy( را محاسبه کرد. جهت راحتی کار پیشنهاد می شود از آب مقطر با دانسیته نزدیک به ۱ استفاده شود.
نـهـایـتـا مطابق با استاندارد (۲ Part 8655 )ISO که کـامـل تـریـن و مـعتبرترین راه کارها را بدین منظور مـطــرح کــرده، بــرای هــر سـمـپـلـری یـک حـد مـجـاز تغییرات یا محدوده خطا )Error limit( تعریف شده که در صـورت خـارج بـودن نتـایـج سمپلـر از محـدوده تعریف شده، حتما می بایست سمپلر کالیبر شود.
در روش رنگ سنجی که اصول آن در بخش هفتم استاندارد ۸۶۵۵ ISO مطرح شده معمولا از یک رنگ تجارتی آماده، غلظتی تهیه و توسط اسپکتروفتومتر در یـک طـول مـوج مـشـخص در مقابل بلانک آب مقطر، میزان جذب آن قرائت می‌شود. نهایتا در اینجا هم مثل روش قبل میانگین انحراف معیار، ضریب تغییرات )cv( محاسبه می شود که cv به دست آمده نماینده دقت سمپلر است. در این روش هم نهایتا می بایست خطای کل را محاسبه و با محدوده خطای ‌ سمپلر مقایسه کرد.
از آنجا که سمپلرهای به کار رفته در روش الایزا مـعـمــولا مـتـغـیــر هستنـد مطـابـق دستـورالعمـل هـای مـوجود، لازم است در ۳ نقطه از محدوده فعالیت سمپلر، حجم اسمی، ۵۰ درصد حجم اسمی و ۱۰ درصـد حـجـم اسـمی کلیه محاسبات انجام گیرد و میزان صحت و دقت در هر نقطه محاسبه شوند تا از صحت وسیله در کل محدوده آن آگاه شوید.
از آنـجـا کـه کـنـتـرل کـیـفـی مـطرح شده در روش گراوی‌متری وابسته به دما و ترازو است و کالیبره بــــودن آن هــــا مــــورد نــظــــر اســــت لــــذا روش هــــای گراوی‌متری از اهمیت و کاربرد بیشتری برخوردار است. در روش های رنگ سنجی کالیبره بودن کلیه ظـــــــروف آزمــــــایـــشـــگــــــاهــــــی، تــــــرازو و دســـتـــگــــــاه اسپکتروفتومتر مورد استفاده مطرح هستند و از آنجا که خوانش جذب انجام شده به پارامترهای مختلفی بستگی دارد که همگی در نتیجه تأثیرگذارند، انجام این روش را در آزمایشگاه با مشکل مواجه می سازد.



تکنیک های ارزیابی و تایید کالیبراسیون الایزا

روش های سنجش ایمنی (Immunoassay) کاربرد وسیعی در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی دارند و از میان این روش ها، الایزا به دلیل ویژگی های خاص خود از جایگاه بالایی برخوردار است که به صورت روز افزون نیز بر گوناگونی و تنوع آن افزوده می شود.به طور کلی ایمونواسی …
با توجه به توضیحات بالا، جهت دستیابی به نتایج دقـیـق، بـررسـی امکانات به کار رفته در روش‌های الایــزا ضــروری بــه نـظــر مــی رســد. ارزیــابــی دقـیـق تجهیزات خصوصا مطابق برنامه ارائه شده توسط تـولیـدکننـدگـان مطـابـق بـا استانداردهای بین‌المللی تــوســط کــاربــران آزمــایشگـاهـی و همچنیـن بخـش خدمات شرکت های تولید کننده صورت می‌گیرد. بـایـد در نـظـر داشت که به جهت ارزیابی عملکرد، تـجـهـیـزات مـطـرح شـده را نـمـی توان روزانه تحت برنامه کالیبراسیون قرار داد.
‌اخیرا برخی شرکت های تولید کننده کیت های آزمایشگاهی جهت ارزیابی عملکردی یک روش الایـزا مـعـرفـی کرده اند که با استفاده ازآن می توان عـملکرد الایزا ریدر ، واشر و سیستم سمپلینگ را مورد ارزیابی قرار داد.
ساختار این کیت ها، مشابه سایر کیت های الایزا بوده که به راحتی توسط کاربران در آزمایشگاه قابل انجام هستند. محتویات این کیت ها شامل یک ماده رنگی غلیظ، محلول شستشو و سوسیترا TMB. این روش پارامترهای مهمی چون خطی بودن )linearity( و دقت )precision( الایزا ریدر، کارایی )efficiency( الایزا واشر و صحت )Accuracy( سمپلر یا سیستم توزیع چه دستی و چه دستگاهی را مورد ارزیابی قرار می‌دهد.
این روش قادر به شناسایی هرگونه اختلالی در پروسه الایزا است . ضمنا با استفاده از این کیت به طور منظم، مدارکی ثبت می شوند که قادر است به عنوان یک سند عملکرد امکانات و تجهیزات عمل و حتی سطوح عملکردی این امکانات را در مقاطع مختلف زمانی با یکدیگر مقایسه کند.

تست خطی بودن خوانشگر
Reader Linearity
در اینجا به روش ساده با استفاده از یک رنگ و ایجاد رقت های پیاپی در چاهک های یک استریپ از پلیـت الایـزا به میزان مشخصی قرار داده و نهایتا با استفاده از دستگاه خوانشگر میزان جذب چاهک‌ها در طـول مـوج هـای خاصی اندازه گیری می شود. نمودار مقادیر به دست آمده جذب را در مقابل رقت مــی تــوان در کــاغــذ لـگـاریتمـی رسـم کـرد. دستگـاه مـی‌بـایـسـت تـا جـذب ۱/۰‌ خـطـی بـاشـد. در ایـنـجا با اسـتـفـاده از یـک اسـتریپ جداگانه و انجام همزمان تست به صورت دوبلیکیت می توان تجدیدپذیری و دقت پیپت و روش را نیز بررسی کرد.توصیه می شود کـه آزمایش در دو مرتبه و به صورت ماهانه انجام گیرد.

تست دقت خوانشگر و راندمان واشر
با استفاده از کیت نامبرده در این مرحله می توان دقت (precision) میکروپلیت ریدر را با شناسایی از طریق محاسبه ضریب تغییرات (cv) تشخیص داد.
تـوصـیـه مـی شـود ایـن آزمـایش ساده به صورت هفتگی انجام گیرد.
روش آزمـــایــش ســاده اســت. بــه چــاهــک هــای استریپ ها میزان ثابتی از کنژوگه اضافه کرده و در مـوج هـای خـاصـی خـوانـده مـی شـود. کـه در اینجا می‌‌توان میانگین مقادیر خوانده شده را محاسبه و نهایتا میزان ضریب تغییرات )cv( به دست می آید، که cv زیر ۵ درصد قابل قبول است.
در ادامـه بـا شستـن استـریـپ هـا بـا بـافـر شستشـو موجود در کیت چهار مرتبه و اضافه کردن سوبسترا و محلول توقف آزمایش می توان در mm450 جذب را خوانده که در اینجا خوانش هر چاهک می بایست کمتر از ۱/۰ بوده که در صورت بالاتر بودن نشانه عدم کـارایـی شـسـتـشـو بوده و می‌بایست شستشو مورد بازبینی قرار گیرد.
آزمایش صحت پیپت
این بخش از آزمایش جهت هر دو روش توزیع دستی و دستگاهی کاربرد دارد. نتایج این آزمایش جهت ارزیابی صحت )accuracy( سمپلرها، دقیق بوده و در صورت دریافت نتایج ناخواسته می توان عملکرد کاربر یا عدم کالیبره بودن دستگاه را مورد ارزیابی قرار دارد.
در اینجا با استفاده از سمپلر رقتی از محلول رنگی تهیه و به میزان مشخصی به چاهک های یک استریپ اضافه و در انتها آب مقطر به آن اضافه کرده جذب چــاهــک هــا در یــک طـول مـوج مـشـخـص قـرائـت می‌شود.
در نـهــایــت مـیــانـگـیــن، انـحـراف معیـار وضـریـب تغییرات را محاسبه می کنیم و در اینجا هم cv نباید بـیـش‌تـر از ۵ درصـد بـاشـد. ضمنا با محاسبه دقت می‌توان دقت عملکرد سمپلر چه به روش دستی یا دسـتگاهی را محاسبه کرد. همانطوری که توضیح داده شد می توان به راحتی با امکانات موجود در یک کیت در آزمایشگاه و در یک پرید زمانی مشخص تجهیزات و امکانات یک روش الایزا را مورد آزمون قـرار داد، خـصـوصـا ایـن روش در فواصل تعمیر و نـگـهـداری دسـتـگـاه ها از اهمیت بالایی برخوردار است. نتایج به دست آمده از انجام آزمایش مستند بـوده و مـی‌تـوان جـهـت آزمایشات بعدی به عنوان مرجع قرار گیرد و نتایج به دست آمده در زمان های مختلف را با یکدیگر مقایسه کرد.




منبع:انجمن مهندسی پزشکی